¿Qué es el análisis HPLC?

En la investigación de nuevos materiales es fundamental disponer de técnicas analíticas que ofrezcan información precisa acerca de mezclas complejas que definan la calidad en la formulación de un producto que se quiera diferenciar en el mercado. Por ello, cobra gran importancia la disponibilidad de técnicas de separación y detección analítica para este tipo de mezclas, como es el Análisis HPLC o Análisis de Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento.

En este artículo vamos a explicar en detalle la HPLC, uno de los ensayos de caracterización analítica más interesantes que utilizamos en nuestros proyectos.

Cómo funciona el equipo de análisis HPLC

La cromatografía líquida de alta resolución, también denominada de alta presión (HPLC), es una técnica analítica que permite la separación de mezclas complejas. Su principio básico es el mismo que en una cromatografía líquida convencional: se introduce la muestra en un tubo (llamado columna de cromatografía), compuesto por partículas porosas (denominadas fase estacionaria) que interaccionan de forma física y/o química con los componentes de la muestra y los separan.

Los componentes separados se recogen a la salida de la columna y se identifican mediante una técnica de medición externa, como un espectrofotómetro que mide la intensidad del color, o mediante otro dispositivo capaz de cuantificar su cantidad.

Cómo se realiza una medida de análisis HPLC

Como hemos indicado anteriormente, el principio de funcionamiento del análisis HPLC es el mismo que el de la cromatografía líquida, con la diferencia de que el HPLC ofrece mayor velocidad, eficacia y sensibilidad.

En este caso, se inyecta un pequeño volumen de muestra líquida en un tubo denominado columna, compuesto por partículas micrométricas (estas se conocen como fase estacionaria), donde los componentes individuales de la muestra se desplazan con un líquido (este se conoce como fase móvil) a través de la columna mediante la alta presión suministrada por una bomba.

Durante el desplazamiento de los componentes por la columna, se producen interacciones físicas y/o químicas con las micropartículas que la componen, dando lugar a su separación. Tras ello, los componentes separados se detectan a la salida mediante un detector que genera una señal llamada cromatograma.

En el cromatograma se pueden distinguir los picos cromatográficos de cada uno de los componentes separados, cuya señal se representa en función del tiempo tras la inyección. Cada análisis mediante HPLC suele requerir entre 10 y 30 minutos.

Tipos de cromatografía líquida HPLC

La pieza clave en el análisis HPLC es la separación de los componentes de la muestra. Para ello, la muestra debe interaccionar con las micropartículas que componen la columna. Como consecuencia de esta interacción, física o química, se logra la separación.

Tal es su importancia que se han desarrollado diferentes modos de separación. Los más importantes utilizados para la mayoría de los compuestos son los siguientes:

• Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). En este tipo de separación, las moléculas se difunden en un medio poroso. La separación depende de la relación entre su tamaño y el tamaño del poro. Es decir, las moléculas más grandes que el diámetro del poro no se difundirán, mientras que las más pequeñas sí lo harán. En este tipo de cromatografía, las moléculas grandes eluyen primero. Se utiliza habitualmente para el análisis de polímeros y proteínas.
• Cromatografía de intercambio iónico. En este caso, la columna se compone de partículas con grupos iónicos y la fase móvil es un tampón acuoso. Esta técnica se emplea para la separación de aniones y cationes, tanto inorgánicos como orgánicos, en solución acuosa. Un ejemplo es la separación de aminoácidos y proteínas.
• Cromatografía de adsorción o fase normal. En este modo, el relleno de la columna es polar y la fase móvil es apolar. Se utiliza para analizar compuestos sensibles al agua, isómeros geométricos y compuestos quirales.
• Cromatografía de fase reversa. Es el modo más utilizado. En este tipo de separación, el relleno de la columna es apolar y la fase móvil es un disolvente orgánico miscible en agua. Puede emplearse para moléculas no polares, polares, ionizables e iónicas. Para muestras muy complejas, con un gran número de constituyentes, se utiliza la elución en gradiente.

Aplicaciones del análisis HPLC

Tal y como hemos indicado, el análisis HPLC es una potente herramienta de análisis. Principalmente, permite obtener información muy valiosa acerca de mezclas complejas, independientemente de su naturaleza.

A continuación, se presentan algunas de sus aplicaciones más importantes:

• Separación y análisis de compuestos no volátiles o termoestables. Algunos ejemplos comunes son fármacos, proteínas, polímeros, compuestos inestables como el trinitrotolueno o aceites de motor.
• Análisis cualitativo de compuestos individuales. Gracias a la información que proporciona el cromatograma sobre el tiempo de retención, es posible identificar los compuestos con gran precisión, relacionándolos con su estructura química o peso molecular.
• Análisis cuantitativo de compuestos individuales. Siempre que esté disponible un patrón (cantidades conocidas de un compuesto), se puede determinar con exactitud su cantidad a partir de la relación entre las señales del patrón y de la muestra. La altura y/o anchura de los picos permite obtener valores cuantificables.
• Preparación de compuestos puros. Esta aplicación deriva de las anteriores. A partir de la relación entre la concentración del compuesto de interés y la señal obtenida, es posible ajustar su pureza, por ejemplo mediante la evaporación de disolventes y el seguimiento de la señal.
• Análisis de trazas. Permite detectar sustancias presentes en concentraciones inferiores al 1 % en peso. Este tipo de análisis resulta especialmente útil en la detección de sustancias tóxicas en fármacos o en muestras medioambientales.

Ventajas de la cromatografía líquida de alta resolución

• Análisis cuantitativo y cualitativo de mezclas complejas. Permite separar y analizar componentes de mezclas complejas, identificando cada compuesto de forma individual y cuantificando su concentración con gran precisión. Esto es especialmente útil en farmacéutica, alimentos y muestras ambientales.
• Detección de trazas. Gracias a su alta sensibilidad, puede detectar incluso cantidades mínimas de sustancias, lo que permite identificar contaminantes, impurezas o metabolitos que pasarían desapercibidos con otras técnicas.
• Automatización. Los sistemas modernos de HPLC permiten automatizar la inyección de muestras, la elución y la adquisición de datos, aumentando la reproducibilidad y reduciendo la posibilidad de errores humanos.
• Alta sensibilidad y precisión. Combinando columnas de alta eficiencia con detectores avanzados, ofrece resultados muy precisos y reproducibles, incluso para compuestos difíciles de analizar, garantizando mediciones confiables.

Nuestro servicio de cromatografía líquida HPLC

En ATRIA somos conscientes del potencial del análisis HPLC para el análisis de mezclas complejas. También resulta clave en el control de calidad de procesos industriales, donde la presencia de contaminantes podría disminuir el valor de mercado de un producto.

Por ello, ATRIA dispone de un equipo de profesionales técnicos capaces de desarrollar la mejor metodología de trabajo en HPLC para cada caso. Desde la búsqueda bibliográfica de procedimientos analíticos hasta la resolución de anomalías en productos, ATRIA ofrece un amplio abanico de herramientas analíticas de gran valor como el HPLC.

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